一、操作步驟:
1、在37℃ 5% CO2條件下將細(xì)胞加在處理的載玻片上,用培育基培育,時(shí)間通過預(yù)試驗(yàn)確定;
2、細(xì)胞長好后,用洗刷液洗2分鐘×3次,室溫下將其放入細(xì)胞固定液中固定30-60min,蒸餾水洗刷;
3、室溫下用洗刷液充沛洗刷固定細(xì)胞,(干燥后-20℃冰凍保存2周以上)
4、雜交前將固定的細(xì)胞進(jìn)行如下處理;順次在70%,90%,100%的乙醇中浸泡,脫水每次5min,用二jia苯洗刷,除掉殘留脂質(zhì)順次在100%,90%,70%乙醇中浸泡,進(jìn)行再水化,每次5min,后浸泡于洗刷液中;
5、在37℃用胃蛋白酶溶液10min處理固定的細(xì)胞,以增加細(xì)胞對大分子試劑的通透性,再用洗刷液洗5min;
6、用1%甲醛固定10min,用洗刷液洗凈。
二、留意:
1、所有溶液都必須用RNA酶抑制劑處理。
2、操作中重要的是及時(shí)固定,并在固定液中加入0.1%的DEPC處理,以抑制RNA酶對mRNA的分解作用。此外,過度固定對原位雜交有明顯的不利影響。
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